PCR
Antes de Ler este tópico leia sobre endonucleases de restrição
Intro
Até recentemente, análise da sequência e da função de uma região específica de DNA requeria quantidades
relativamente grandes de um segmento purificado de DNA. A produção rápida de grandes quantidades de
unia sequência específica de DNA deu um salto para frente com o desenvolvimento da reação da polimerase em cadeia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. O objetivos da técnica é multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotídeos como monômeros até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por
Mullis (desenvolvedor da técnica) na verdade propôs uma técnica que consegue resolver um grande problema da análise de ácidos nucléicos: sua baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos.
Esse processo amplifica a região de DNA de interesse duas vezes, com uma especificidade muito aumentada. PCR tem muitas aplicações em diagnóstico genético, investigações forenses para as
quais apenas uma gota de sangue seco ou um único fio de cabelo está disponível, e em estudos de evolução com material biológico preservado.
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo (também
chamado de template), um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos
iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofator Mg2+. Esta
mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem nas seguintes etapas:
- Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
- Hibridização dos iniciadores (ou associação dos iniciadores) por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reação é esfriada (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
- Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi
desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada,
os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA
polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o
isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA
polimerase) que atua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da
especificidade da reação. O produto de PCR pode ser visualizado após eletroforese em
gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de
DNA.
Reagentes Necessários
A reação SEMPRE parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra, ou
de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal é que o
ácido nucléico esteja livre de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucléico,
reagentes de extração, etc.) e numa concentração mínima de 5μg/mL, apesar de
quantidades bem menores poderem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a
utilizar quantidades de até 10-12 mol de DNA).
A DNA polimerase: A mais utilizada ainda é a Taq, numa concentração que varia de 1 a 4U por microlitro de solução. Normalmente, a maioria das DNA polimerases disponíveis no mercado são fornecidas conjuntamente com uma solução-tampão específica, cuja composição varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas soluções contêm íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condições de reação. Alguns tampões contêm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina Sérica Bovina) e algumas substâncias que agem na denaturação da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, βmercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
Um reagente de importância crítica é o MgCl2 , doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam outros íons metálicos como cofatores. Um desses casos, e talvez o mais interessante é a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta enzima possui atividade DNA polimerásica em presença de íons Mg2=; porém, na presença de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir
de uma cadeia de RNA. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita
para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP)
desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTP´s em concentrações iguais à reação. Os dNTP´s são ligados à fita-mãe pela polimerase numa área delimitada pelos primers, que são pequenas seqüências de DNA (12 a 35 bases) complementares às bordas.
Tipos de reações de PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): Esta reação é composta de 2 partes:
a transcrição reversa e a amplificação propriamente dita. Seu principal diferencial é que
na verdade esta reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra;
a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar).
Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mRNA, podemos
detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas. No entanto, o estudo direto
do RNA (principalmente o mRNA) é inviável, devido à sua alta sensibilidade a vários
fatores e a altas temperaturas. O primeiro passo da reação consiste na síntese de uma fita
de DNA utilizando como template uma fita de RNA numa reação catalisada por uma
transcriptase reversa. Usualmente, são utilizadas duas enzimas desta classe, extraídas de
vírus: a AMV (Avian Mieloblastosis Vírus) e a M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia
Vírus). Além disso, também são utilizados primers, mas inespecíficos e nunca em pares.
São oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo, obtém-se o cDNA que será utilizado na PCR. É importante ressaltar que o round de transcrição reversa não altera o número de fitas de RNA ou DNA.
Multiplex PCR: Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação,
cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns
experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos
devem ser analisados. Também é útil para a introdução de um controle de reação (a ser
discutido posteriormente).
Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências
localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real
seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou
em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
Real time PCR: PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de
DNA, porém a detecção do resultado e feita a longo dos ciclos. Para que isso ocorra
uma molécula conhecida como SYBR green ou um oligonucleotídeo marcado com
reporter e quencher é adicionado na reação e conforme a amplificação ocorre ao final de
cada ciclo é emitido um sinal fluorescente que é captado por um sistema óptico e
convertido em um gráfico de amplificação. Através desta técnica níveis mais altos de
sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação se torna menor.
PCR-RFLP: submete-se o material amplificado de uma reação de PCR a enzimas digestivas (endonucleases de restrição) que cortam o DNA em posições constantes dentro de um sitio, desta forma o perfil de restrição de um único gene conhecido possa ser comparado com o perfil de outra cepas ou sorogrupos bacterianos.
RAPD-PCR: consiste na amplificação randômica do DNA por um par de iniciadores de
baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.
Esta técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, possibilitando sua
comparação entre isolados de amostras clinicas.
Referência:
PCR Applications Manual, 3rd Edition, Roche Applied Science
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