ELETROFORESE
INTRO
A descoberta de Endonucleases de Restrição tornou possível produzir DNA recombinante em laboratório, mimetizando um processo que frequentemente ocorre na natureza. A capacidade de escolher genes específicos e aumentar o suprimento disponível de seus DNAs permite um grau de manipulação dos organismos vivos muito além do alcançado por cruzamento selecionados. Qualquer método de separação depende nos níveis de diferença entre os itens a serem separados. Carga e tamanho são duas propriedades moleculares frequentemente utilizadas para a separação.Uma das técnicas mais utilizadas em biologia molecular, a eletroforese em gel, emprega essas duas propriedades. A eletroforese baseia-se na movimentação das partículas carregadas em um campo elétrico. Oligonucleotídios possuem grupos fosfatos que são eletricamente negativos em PH neutro.Ingredientes do processo:
Além do material genético já processado pela técnica de PCR.Gel:
Os mais famosos são o gel de Agarose, utilizada para fragmentos maiores, e Poliacrilamida, fragmentos menores.Agarose:Polissacarídeo em forma de pó. Quando suspenso em solução aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai. Enquanto está em forma líquida, é colocado num molde que lhe dará o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso são feitos pequenos furos (poços) em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um “pente”; são os poços que receberão o produto da PCR. Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V, e corrente de 50 a 3000mA. São utilizadas concentrações de 0,5 a 3% de agarose no gel. Quanto maior a concentração, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos próximos, fator denominado DEFINIÇÃO. Por exemplo, um gel de agarose a
1% pode separar fragmentos com uma diferença de tamanho de 80 pares de bases,
enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferença de no mínimo 30 pares de
bases.
Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de agarose:
a) tamanho da molécula de DNA
b) concentração da agarose
c) conformação do DNA (formas circulares ou não lineares: I; II e III)
d) a presença de brometo de etidium no gel
e) voltagem aplicada
f) tipo de agarose
g) tipo do tampão de eletroforese
Poliacrilamida:Polimeriza-se a partir da reação da acrilamida (C3H5NO) com a BisAcrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) em presença de perssulfato de amônio e catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampão de corrida desejado, é posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante à utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Também é posto um pente para a formação de poços.Após a polimerização, os procedimentos são os mesmos em relação a um gel de agarose: Cobertura pelo tampão de corrida na cuba de eletroforese, aplicação das amostras e do ladder, aplicação da corrente elétrica.Normalmente, utiliza-se géis com concentrações de 4 a 25% de acrilamida. A poliacrilamida apresenta definição muito maior do que a agarose: um gel de 10% pode em certas condições separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases A identificação dos produtos pode ser feita pela coloração com EtBr, porém
o método mais utilizado é a impregnação do DNA contido no gel por nitrato de prata.
Tampão para controlar PH:
TAE (Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)
TPE (de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)
TBE (Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDT
Tampão de carregamento:
O tampão de carregamento é misturado às amostras antes de carregar o gel e possui três
finalidades:
1) aumentar a densidade da amostra
2) adicionar cor às amostras para visualizar a corrida eletroforética no gel
3) simplificar o processo de carregamento
Coloração do gel:
Brometo de etidium (agarose e poliacrilamida)
O brometo de etidium intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento,
após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo van der Waals. Incolor a olho nu, o Brometo de Etidium ao receber radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante (impregnado pelo PCR tornando a molécula ou banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. Ele é altamente cancerigeno, pois penetra no organismo e é agente alquilante.
SYBR GOLD (agarose e poliacrilamida)
Nitrato de Prata (agarose e poliacrilaminda)
Fotodocumentador.
Processo:
Primeira Etapa:
Solução 1
TBE 10x:
Tris Base = 121,1g concentração 1M
Acido Bórico Anidro =55.6g concentração 0,9M
NA2 EDTA 2H20 = 3,7g, 10mM
H2O deionizada ou Milli-Q = 1L com PH 8,3 a 25°C
Solução 2 ou TBE 1x:
- 100ml de TBE 10x + 900ml de H2O (Milli-Q)
Segunda Etapa:
Tampão de carregamento (loading buffer):
Para gel de Agarose:
- 50% (peso/volume) glicerol (H2O DEPC)
- 10 mM EDTA (pH 8,0). PM (EDTA) = 372,24 g/mol/litro
- 0,25% (peso/volume) azul de bromofenol (bromophenol blue)
Em um Becker colocar 5 mL de glicerol + 5 mL de água tratada com DEPC (dietil
pirocarbonato) + 37,22 mg (não ultrapassar 39mg!!!!) de EDTA, homogeneizar e acertar o pH em 8,0
Acrescentar 25 mg de azul de bromofenol homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL)
em 10 microtubos (1,5 mL) armazenar a temperatura de 4°C.
Para gel de Poliacrilamida:
- 30% (p/v) glicerol (H2O DEPC)
- 0,25% (p/v) azul de bromofenol
- 0,25% (w/v) xileno cianol FF(xylene cyanol FF)
Em um Becker colocar 3 mL de glicerol + 7 mL de água DEPC, acrescentar 25mg de azul de bromofenol + 25mg de xileno cianol FF homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL) em 10 microtubos (1,5 mL). Armazenar a temperatura de 4oC.
Terceira Etapa:
Gel de Agarose:
Variação da % do gel de agarose para separação de diferentes quantidades de DNA
esperado:
Concentração de Agarose no gel (%[peso/volume]) | Moleculas lineares de DNA (Kb)
0,3 | 5-60
0,6 | 1-20
0,7 | 0,8-10
0,9 | 0,5-7
1,2 | 0,4-6
1,5 | 0,2-3
2,0 | 0,1-2
Gel de agarose (1%)
- 100 mL de TBE 1X / 1g de agarose
- Aquecer o gel de agarose no microondas até iniciar fervura
- Esperar diminuir a temperatura para 50-60°C
- Verificar o nível da forma e preparar o pente para os poços
- Despejar o gel de forma homogênea
- Passar delicadamente os pentes pelo gel para desfazer possíveis bolhas de ar colocando-os na posição adequada
- Deixar secar e retirar os pentes
- Colocar o tampão TBE 1X até cobrir o gel.
Carregamento do gel horizontal:
- Colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento
- 10% do volume da amostra (ex.: para 15microL da amostra, utilizar 1,5microL)
- Colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem com o pipetador
- Carregar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado para não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho
- Adicionar o Marcador de Peso Molecular (DNA Ladder) no primeiro poço do gel
- Conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para cada gel (1-5 V/cm para géis médios ou grandes e 5-20 V/cm para mini-géis)Roteiro de Estudos
Gel poliacrilamida não denaturante:
Variação da % do gel de poliacrilamida e tipos de corantes para separação de
diferentes quantidades de DNA esperado:
Concentação do Gel (%) | Intervalo de separação (bp) | Xileno Cianol FF | Bromophenol Blue
3,5 | 1000-2000 | 460 | 100
5,0 | 80-500 | 260 | 65
8,0 | 60-400 | 160 | 45
12,0 | 40-200 | 70 | 20
15,0 | 25-150 | 60 | 15
20,0 | 6-100 | 45 | 12
Volume de Reagentes Utilizados:
% gel | 29:1 acri-bis (mL) | H20 (mL)| TBE 10X H2O (mL) | PA(10%[mL])
3,5 | 11,6 |77,7 | 10,0 | 0,7
5,0 | 16,6 |72,7 | 10,0 | 0,7
8,0 | 26,6 |62,7 | 10,0 | 0,7
12,0 | 40,0 |49,3 | 10,0 | 0,7
20,0 | 66,6 |22,7 | 10,0 | 0,7
Soluções estoque:
Acrilamida (29):(1) Bisacrilamida
- 29g Acrilamida
- 1g N,N’ - Metilenebisacrilamida
- Completar para 100mL de H2O deionizada e destilada ou Milli-Q, homogeneizar sob placa agitadora aquecida
- Armazenar à 4°C
Persulfato de amonio (PA [10%])
- 1g Persulfato de amonio
- Completar para 10mL de H2O deionizada e destilada ou Milli-Q (armazenar à 4°C)
Gel de poliacrilamida não denaturante (5%)
- 16,6mL solução estoque (29:1)
- 0,7mL de PA (10%)Roteiro de Estudos
- 10,0mL de TBE 10x
- 72,7mL de H2O
- Adicionar 35microL de TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) somente na hora de preparar o gel
- Homogeneizar sob placa agitadora
- Limpar as placas de vidro para montagem do gel com etanol (do lado onde for aplicar o gel), colocando os espaçadores adequados para espessura do gel desejado
- Colocar a placa num ângulo de aproximadamente 20°
- Colocar o gel com auxílio de uma seringa de forma homogênea sem deixar fazer bolhas (“rapidamente”)
- Deixar a placa na posição vertical
- Colocar o pente e completar com os espaços para formar corretamente as paredes dos poços
- Deixar polimerizar até atingir um padrão de “Schlieren” visível e logo após retirar os pentes delicadamente
- Com auxílio de uma seringa, lave os poços do gel usando tampão TBE 1X
- Coloque a placa no tanque e cubra-o com tampão TBE 1X
Carregamento do gel vertical:
- Colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento 10% do volume da amostra (ex.: para 15microL da amostra, utilizar 1,5microL)
- Colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem com o pipetador
- Colocar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado de não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho
- Adicionar o DNA Ladder (marcador)
- Conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para o gel (1-8 V/cm)
Quarta Etapa:
Coloração do gel:
Brometo de etidium (BE):
- BE estoque - 10mg/ml
- 1 pastilha de BE contém 100mg, portanto, diluir 1 pastilha em 10 ml de H2O Milli-Q.
Corando o gel antes da corrida (agarose):
- BE no gel - 0,5 microg de BE por mL de gel
Corando o gel depois da corrida (agarose e poliacrilamida):
- Fazer o gel sem BE
- Preparar solução corante de BE/TBE 1X (1l de BE estoque / 10ml TBE 1X)
- Manter essa solução no tupeware por no máximo 3 dias (o BE acaba perdendo sua ação pela ação da luz solar)
- Preparar solução suficiente para cobrir o gel e colocá-la no tupeware
- Após a corrida colocar o gel imerso na solução corante por 30 minutos (gel de agarose) ou 15 minutos (gel de poliacrilamida)
- Após aguardar o tempo necessário para cada gel, este estará pronto para fotodocumentação ou captura de imagem do gel.
Quinta Etapa:
Fotodocumentação ou captura de imagem do gel:
Referência Bibliográfica:
Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3th
Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.
Bioquímica: Volume 2, bioquímica básica/ Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell ; tradução All Tasks;
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