Duas moléculas de Aminoácido podem se unir e formar uma ligação peptídica produzindo um dipepitídio. Na reação ocorre a liberação de uma molécula de água. Quando uns poucos aminoácidos são unidos dessa maneira, a estrutura formada é chamada de oligopeptídio. Quando muitos aminoácidos são unidos, o produto é chamado de um polipeptídio. Polipeptídios geralmente possuem um peso molecular abaixo de 10.000, e aquelas chamadas proteínas possuem pesos moleculares maiores.
Em um peptídio, o resíduo de aminoácido na extremidade com o grupo amino é chamado de resíduo terminal amino (ou N-terminal); o termnal quie possui o grupo carboxila livre é o resíduo terminal carboxila (ou C-terminal).
Algumas proteínas consistem de uma ceia polipeptídica única, mas outras, chamadas de proteínas subunidades múltiplas, possuem dois ou mais peptídios associados de forma não-covalente. As cadeias polipeptídicas individuais em uma proteína de subunidades múltipla podem ser idênticas ou diferentes. Se pelo menos duas são idênticas, a proteína é dita OLIGOMÉRICA, e as unidades idênticas (consistindo de uma ou mais cadeias de polipeptídios) são referidas como protômeros.
Algumas proteínas contêm permanentemente associados outros componentes químicos além dos aminoácidos; essas são chamadas de PROTEÍNAS CONJUGADAS. A parte não-aminoácido de uma proteína conjugada é usualmente chamada de seu grupo prostético. Proteínas conjugadas são classificadas com base na natureza química dos seus grupos prostéticos:
Classe | Grupo prostético | Exemplo
Lipoproteínas | Lipídios | Beta1- lipoproteína do sangue
Glicoproteínas | Carboidratos | Imunoglobulina G
Fosfoproteínas | Grupos fosfatos | Caseína do Leite
Hemoproteínas | Heme (porfirina da ferro) | Hemoglobina
Flavoproteínas | Nucleotídíos de Flavina | Desidrogenase succínica
Metaloproteínas | Ferro | Ferritina
Zinco | Desidrogenase alcoólica
Cálcio | Calmodulina
Molibdênio | Dinitrogenase
Cobre | Plastocianina
Fonte: Princípios de Química, Lehninger , Quarta edição
domingo, 10 de março de 2013
segunda-feira, 4 de março de 2013
Assistência Farmaceutica
Parte 1
Constituição de 88Lei 8080
Política de Medicamentos
Política Nacional de Assistência Farmaceuticas
Lei 12.401/2011
Parte 2
Parte 3
Parte 4
Parte 5
Endonucleases de Restrição
Endonucleases de Restrição
Os métodos desenvolvidos especificamente para manipular o DNA dependem da disponibilidade de enzimas especificas para produzir fragmentos de DNA de tamanho manuseável. Essas enzimas são denominadas endonucleases de restrição.
Cada endonuclease de restrição hidrolisa somente uma ligação especifica de uma sequência especifica do DNA. As sequencias conhecidas por endonucleases de restrição - seus sítios de ação - são lidas de forma idênticas tato da esquerda para a direita como ao contrario ( na fita complementar). O termo para essa sequência é palíndromo. ("Socorra-me, subi no ônibus em Marrocos!" e "Roma me tem amor!").
domingo, 3 de março de 2013
PCR
PCR
Antes de Ler este tópico leia sobre endonucleases de restrição
Intro
Até recentemente, análise da sequência e da função de uma região específica de DNA requeria quantidades
relativamente grandes de um segmento purificado de DNA. A produção rápida de grandes quantidades de
unia sequência específica de DNA deu um salto para frente com o desenvolvimento da reação da polimerase em cadeia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. O objetivos da técnica é multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotídeos como monômeros até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por
Mullis (desenvolvedor da técnica) na verdade propôs uma técnica que consegue resolver um grande problema da análise de ácidos nucléicos: sua baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos.
Esse processo amplifica a região de DNA de interesse duas vezes, com uma especificidade muito aumentada. PCR tem muitas aplicações em diagnóstico genético, investigações forenses para as
quais apenas uma gota de sangue seco ou um único fio de cabelo está disponível, e em estudos de evolução com material biológico preservado.
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo (também
chamado de template), um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos
iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofator Mg2+. Esta
mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem nas seguintes etapas:
- Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
- Hibridização dos iniciadores (ou associação dos iniciadores) por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reação é esfriada (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
- Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi
desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada,
os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA
polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o
isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA
polimerase) que atua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da
especificidade da reação. O produto de PCR pode ser visualizado após eletroforese em
gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de
DNA.
Reagentes Necessários
A reação SEMPRE parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra, ou
de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal é que o
ácido nucléico esteja livre de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucléico,
reagentes de extração, etc.) e numa concentração mínima de 5μg/mL, apesar de
quantidades bem menores poderem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a
utilizar quantidades de até 10-12 mol de DNA).
A DNA polimerase: A mais utilizada ainda é a Taq, numa concentração que varia de 1 a 4U por microlitro de solução. Normalmente, a maioria das DNA polimerases disponíveis no mercado são fornecidas conjuntamente com uma solução-tampão específica, cuja composição varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas soluções contêm íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condições de reação. Alguns tampões contêm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina Sérica Bovina) e algumas substâncias que agem na denaturação da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, βmercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
Um reagente de importância crítica é o MgCl2 , doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam outros íons metálicos como cofatores. Um desses casos, e talvez o mais interessante é a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta enzima possui atividade DNA polimerásica em presença de íons Mg2=; porém, na presença de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir
de uma cadeia de RNA. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita
para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP)
desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTP´s em concentrações iguais à reação. Os dNTP´s são ligados à fita-mãe pela polimerase numa área delimitada pelos primers, que são pequenas seqüências de DNA (12 a 35 bases) complementares às bordas.
Tipos de reações de PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): Esta reação é composta de 2 partes:
a transcrição reversa e a amplificação propriamente dita. Seu principal diferencial é que
na verdade esta reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra;
a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar).
Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mRNA, podemos
detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas. No entanto, o estudo direto
do RNA (principalmente o mRNA) é inviável, devido à sua alta sensibilidade a vários
fatores e a altas temperaturas. O primeiro passo da reação consiste na síntese de uma fita
de DNA utilizando como template uma fita de RNA numa reação catalisada por uma
transcriptase reversa. Usualmente, são utilizadas duas enzimas desta classe, extraídas de
vírus: a AMV (Avian Mieloblastosis Vírus) e a M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia
Vírus). Além disso, também são utilizados primers, mas inespecíficos e nunca em pares.
São oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo, obtém-se o cDNA que será utilizado na PCR. É importante ressaltar que o round de transcrição reversa não altera o número de fitas de RNA ou DNA.
Multiplex PCR: Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação,
cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns
experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos
devem ser analisados. Também é útil para a introdução de um controle de reação (a ser
discutido posteriormente).
Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências
localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real
seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou
em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
Real time PCR: PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de
DNA, porém a detecção do resultado e feita a longo dos ciclos. Para que isso ocorra
uma molécula conhecida como SYBR green ou um oligonucleotídeo marcado com
reporter e quencher é adicionado na reação e conforme a amplificação ocorre ao final de
cada ciclo é emitido um sinal fluorescente que é captado por um sistema óptico e
convertido em um gráfico de amplificação. Através desta técnica níveis mais altos de
sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação se torna menor.
PCR-RFLP: submete-se o material amplificado de uma reação de PCR a enzimas digestivas (endonucleases de restrição) que cortam o DNA em posições constantes dentro de um sitio, desta forma o perfil de restrição de um único gene conhecido possa ser comparado com o perfil de outra cepas ou sorogrupos bacterianos.
RAPD-PCR: consiste na amplificação randômica do DNA por um par de iniciadores de
baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.
Esta técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, possibilitando sua
comparação entre isolados de amostras clinicas.
Referência:
PCR Applications Manual, 3rd Edition, Roche Applied Science
Eletroforese
ELETROFORESE
INTRO
A descoberta de Endonucleases de Restrição tornou possível produzir DNA recombinante em laboratório, mimetizando um processo que frequentemente ocorre na natureza. A capacidade de escolher genes específicos e aumentar o suprimento disponível de seus DNAs permite um grau de manipulação dos organismos vivos muito além do alcançado por cruzamento selecionados. Qualquer método de separação depende nos níveis de diferença entre os itens a serem separados. Carga e tamanho são duas propriedades moleculares frequentemente utilizadas para a separação.Uma das técnicas mais utilizadas em biologia molecular, a eletroforese em gel, emprega essas duas propriedades. A eletroforese baseia-se na movimentação das partículas carregadas em um campo elétrico. Oligonucleotídios possuem grupos fosfatos que são eletricamente negativos em PH neutro.Ingredientes do processo:
Além do material genético já processado pela técnica de PCR.Gel:
Os mais famosos são o gel de Agarose, utilizada para fragmentos maiores, e Poliacrilamida, fragmentos menores.Agarose:Polissacarídeo em forma de pó. Quando suspenso em solução aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai. Enquanto está em forma líquida, é colocado num molde que lhe dará o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso são feitos pequenos furos (poços) em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um “pente”; são os poços que receberão o produto da PCR. Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V, e corrente de 50 a 3000mA. São utilizadas concentrações de 0,5 a 3% de agarose no gel. Quanto maior a concentração, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos próximos, fator denominado DEFINIÇÃO. Por exemplo, um gel de agarose a
1% pode separar fragmentos com uma diferença de tamanho de 80 pares de bases,
enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferença de no mínimo 30 pares de
bases.
Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de agarose:
a) tamanho da molécula de DNA
b) concentração da agarose
c) conformação do DNA (formas circulares ou não lineares: I; II e III)
d) a presença de brometo de etidium no gel
e) voltagem aplicada
f) tipo de agarose
g) tipo do tampão de eletroforese
Poliacrilamida:Polimeriza-se a partir da reação da acrilamida (C3H5NO) com a BisAcrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) em presença de perssulfato de amônio e catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampão de corrida desejado, é posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante à utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Também é posto um pente para a formação de poços.Após a polimerização, os procedimentos são os mesmos em relação a um gel de agarose: Cobertura pelo tampão de corrida na cuba de eletroforese, aplicação das amostras e do ladder, aplicação da corrente elétrica.Normalmente, utiliza-se géis com concentrações de 4 a 25% de acrilamida. A poliacrilamida apresenta definição muito maior do que a agarose: um gel de 10% pode em certas condições separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases A identificação dos produtos pode ser feita pela coloração com EtBr, porém
o método mais utilizado é a impregnação do DNA contido no gel por nitrato de prata.
Tampão para controlar PH:
TAE (Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)
TPE (de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)
TBE (Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDT
Tampão de carregamento:
O tampão de carregamento é misturado às amostras antes de carregar o gel e possui três
finalidades:
1) aumentar a densidade da amostra
2) adicionar cor às amostras para visualizar a corrida eletroforética no gel
3) simplificar o processo de carregamento
Coloração do gel:
Brometo de etidium (agarose e poliacrilamida)
O brometo de etidium intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento,
após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo van der Waals. Incolor a olho nu, o Brometo de Etidium ao receber radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante (impregnado pelo PCR tornando a molécula ou banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. Ele é altamente cancerigeno, pois penetra no organismo e é agente alquilante.
SYBR GOLD (agarose e poliacrilamida)
Nitrato de Prata (agarose e poliacrilaminda)
Fotodocumentador.
Processo:
Primeira Etapa:
Solução 1
TBE 10x:
Tris Base = 121,1g concentração 1M
Acido Bórico Anidro =55.6g concentração 0,9M
NA2 EDTA 2H20 = 3,7g, 10mM
H2O deionizada ou Milli-Q = 1L com PH 8,3 a 25°C
Solução 2 ou TBE 1x:
- 100ml de TBE 10x + 900ml de H2O (Milli-Q)
Segunda Etapa:
Tampão de carregamento (loading buffer):
Para gel de Agarose:
- 50% (peso/volume) glicerol (H2O DEPC)
- 10 mM EDTA (pH 8,0). PM (EDTA) = 372,24 g/mol/litro
- 0,25% (peso/volume) azul de bromofenol (bromophenol blue)
Em um Becker colocar 5 mL de glicerol + 5 mL de água tratada com DEPC (dietil
pirocarbonato) + 37,22 mg (não ultrapassar 39mg!!!!) de EDTA, homogeneizar e acertar o pH em 8,0
Acrescentar 25 mg de azul de bromofenol homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL)
em 10 microtubos (1,5 mL) armazenar a temperatura de 4°C.
Para gel de Poliacrilamida:
- 30% (p/v) glicerol (H2O DEPC)
- 0,25% (p/v) azul de bromofenol
- 0,25% (w/v) xileno cianol FF(xylene cyanol FF)
Em um Becker colocar 3 mL de glicerol + 7 mL de água DEPC, acrescentar 25mg de azul de bromofenol + 25mg de xileno cianol FF homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL) em 10 microtubos (1,5 mL). Armazenar a temperatura de 4oC.
Terceira Etapa:
Gel de Agarose:
Variação da % do gel de agarose para separação de diferentes quantidades de DNA
esperado:
Concentração de Agarose no gel (%[peso/volume]) | Moleculas lineares de DNA (Kb)
0,3 | 5-60
0,6 | 1-20
0,7 | 0,8-10
0,9 | 0,5-7
1,2 | 0,4-6
1,5 | 0,2-3
2,0 | 0,1-2
Gel de agarose (1%)
- 100 mL de TBE 1X / 1g de agarose
- Aquecer o gel de agarose no microondas até iniciar fervura
- Esperar diminuir a temperatura para 50-60°C
- Verificar o nível da forma e preparar o pente para os poços
- Despejar o gel de forma homogênea
- Passar delicadamente os pentes pelo gel para desfazer possíveis bolhas de ar colocando-os na posição adequada
- Deixar secar e retirar os pentes
- Colocar o tampão TBE 1X até cobrir o gel.
Carregamento do gel horizontal:
- Colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento
- 10% do volume da amostra (ex.: para 15microL da amostra, utilizar 1,5microL)
- Colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem com o pipetador
- Carregar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado para não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho
- Adicionar o Marcador de Peso Molecular (DNA Ladder) no primeiro poço do gel
- Conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para cada gel (1-5 V/cm para géis médios ou grandes e 5-20 V/cm para mini-géis)Roteiro de Estudos
Gel poliacrilamida não denaturante:
Variação da % do gel de poliacrilamida e tipos de corantes para separação de
diferentes quantidades de DNA esperado:
Concentação do Gel (%) | Intervalo de separação (bp) | Xileno Cianol FF | Bromophenol Blue
3,5 | 1000-2000 | 460 | 100
5,0 | 80-500 | 260 | 65
8,0 | 60-400 | 160 | 45
12,0 | 40-200 | 70 | 20
15,0 | 25-150 | 60 | 15
20,0 | 6-100 | 45 | 12
Volume de Reagentes Utilizados:
% gel | 29:1 acri-bis (mL) | H20 (mL)| TBE 10X H2O (mL) | PA(10%[mL])
3,5 | 11,6 |77,7 | 10,0 | 0,7
5,0 | 16,6 |72,7 | 10,0 | 0,7
8,0 | 26,6 |62,7 | 10,0 | 0,7
12,0 | 40,0 |49,3 | 10,0 | 0,7
20,0 | 66,6 |22,7 | 10,0 | 0,7
Soluções estoque:
Acrilamida (29):(1) Bisacrilamida
- 29g Acrilamida
- 1g N,N’ - Metilenebisacrilamida
- Completar para 100mL de H2O deionizada e destilada ou Milli-Q, homogeneizar sob placa agitadora aquecida
- Armazenar à 4°C
Persulfato de amonio (PA [10%])
- 1g Persulfato de amonio
- Completar para 10mL de H2O deionizada e destilada ou Milli-Q (armazenar à 4°C)
Gel de poliacrilamida não denaturante (5%)
- 16,6mL solução estoque (29:1)
- 0,7mL de PA (10%)Roteiro de Estudos
- 10,0mL de TBE 10x
- 72,7mL de H2O
- Adicionar 35microL de TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) somente na hora de preparar o gel
- Homogeneizar sob placa agitadora
- Limpar as placas de vidro para montagem do gel com etanol (do lado onde for aplicar o gel), colocando os espaçadores adequados para espessura do gel desejado
- Colocar a placa num ângulo de aproximadamente 20°
- Colocar o gel com auxílio de uma seringa de forma homogênea sem deixar fazer bolhas (“rapidamente”)
- Deixar a placa na posição vertical
- Colocar o pente e completar com os espaços para formar corretamente as paredes dos poços
- Deixar polimerizar até atingir um padrão de “Schlieren” visível e logo após retirar os pentes delicadamente
- Com auxílio de uma seringa, lave os poços do gel usando tampão TBE 1X
- Coloque a placa no tanque e cubra-o com tampão TBE 1X
Carregamento do gel vertical:
- Colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento 10% do volume da amostra (ex.: para 15microL da amostra, utilizar 1,5microL)
- Colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem com o pipetador
- Colocar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado de não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho
- Adicionar o DNA Ladder (marcador)
- Conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para o gel (1-8 V/cm)
Quarta Etapa:
Coloração do gel:
Brometo de etidium (BE):
- BE estoque - 10mg/ml
- 1 pastilha de BE contém 100mg, portanto, diluir 1 pastilha em 10 ml de H2O Milli-Q.
Corando o gel antes da corrida (agarose):
- BE no gel - 0,5 microg de BE por mL de gel
Corando o gel depois da corrida (agarose e poliacrilamida):
- Fazer o gel sem BE
- Preparar solução corante de BE/TBE 1X (1l de BE estoque / 10ml TBE 1X)
- Manter essa solução no tupeware por no máximo 3 dias (o BE acaba perdendo sua ação pela ação da luz solar)
- Preparar solução suficiente para cobrir o gel e colocá-la no tupeware
- Após a corrida colocar o gel imerso na solução corante por 30 minutos (gel de agarose) ou 15 minutos (gel de poliacrilamida)
- Após aguardar o tempo necessário para cada gel, este estará pronto para fotodocumentação ou captura de imagem do gel.
Quinta Etapa:
Fotodocumentação ou captura de imagem do gel:
Referência Bibliográfica:
Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3th
Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.
Bioquímica: Volume 2, bioquímica básica/ Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell ; tradução All Tasks;
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